Exosome外泌体是细胞外泌囊泡中体积较小的一种。近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。外泌体在很多生理病理起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同的细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物，也可用于靶向药物的定向传输。

样本准备：外泌体分离需要多少起始材料？

成功分离外泌体所需的起始材料，取决于你所研究的体液、所选择的分离方法以及将进行的下游分析。外泌体的浓度随体液类型和疾病状态而异。最好对目标体液和疾病所涉及的外泌体浓度进行评估。知道样品所含外泌体的浓度之后，你还需要了解自己所选外泌体分离方法的效率，你可以采用标准化外泌体样品或微球进行计算， 然后可以反推计算达到所需的总体积，其中考虑到样品损耗和外泌体裂解引起的外泌体损耗。成功分离外泌体后，你希望确保所选下游分析具备足够的起始材料（DNA、RNA、蛋白质）。现有方案的初始体积范围最低为3～4mL，最高为50mL。

制备方法：用什么方法分离外泌体，以及如何表征这种混合的外泌体群体？

过滤后采用低转速除去完整细胞、细胞碎片和大聚集体。使用转头速度超过100,000×g 的贝克曼超速离心机高速离心处理2小时以上，可以沉淀、浓缩外泌体。

如需对外泌体群体进一步纯化分离，建议以转速为100,000×g的5～40% 碘克沙醇非连续性密度梯度离心法处理18小时以上。分离外泌体并确认其回收率之后，在台式超速离心机中以超过100,000×g的转速处理外泌体1.5～2小时，即可令外泌体沉淀。外泌体群体一般通过光散射法、二代基因测序法及蛋白质印迹法进行表征。

储备条件：样品储存条件（包括从不同来源分离出来的外泌体温度），以及外泌体分离前生物体液和细胞培养样品的储存条件？

使用的纯化外泌体储存在 -20℃ 条件下，而长期储存的温度则为 -80℃。我们尚未发现不同外泌体来源在储存条件影响方面存在任何差异。

大多数生物体液（尿液、精液、唾液等）可以在分离外泌体之前存放于 -80℃ 条件下。对于细胞培养，大多数细胞系在37℃、5% CO2条件下储存。

内含物表征：如果我们进行以下操作，总共需要花多长时间？

1、从细胞培养基和血浆中提取外泌体
首先是3个不同的沉淀步骤，共需2个小时，接着进行隔夜密度梯度离心步骤，目的是分离出细胞培养基或血浆中的外泌体。

2、RNA分离、NGS和分析 
用Biomek 4000分离RNA约花费3小时，接着是特定RNA类型的富集（供NGS使用）。NGS和分析高度取决于所采用的系统和所进行的分析类型。

外泌体分离纯化的金标准

超速离心分离是从生物体液和细胞培养样品中分离纯化外泌体的黄金标准，可以准确地重复获取外泌体，同时******限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化。

Exosome的离心纯化标准流程

差速离心富集法

密度梯度离心法

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